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熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)
點(diǎn)擊次數(shù)：7737 日期：2013/11/26 15:44:36
一、熒光定量PCR技術(shù)簡(jiǎn)介及原理
熒光定量PCR( realtime fluores-cence quantitative PCR，RTFQ PCR) 是1996 年由美國(guó)Applied Biosystems 公司推出的一種新定量試驗(yàn)技術(shù)，它是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，從而對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR過(guò)程中，熒光染料能特異性摻入DNA雙鏈，發(fā)出熒光信號(hào)，而不摻入雙鏈中的染料分子不發(fā)出熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物增加完全同步。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是一次DNA定量技術(shù)的飛躍，運(yùn)用該項(xiàng)技術(shù)，可以對(duì)DNA 、RNA樣品進(jìn)行定量和定性分析。
二、熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域
臨床疾病診斷：各型肝炎、艾滋病、禽流感、結(jié)核、性病等傳染病診斷和療效評(píng)價(jià)；地中海貧血、血友病、性別發(fā)育異常、智力低下綜合癥、胎兒畸形等優(yōu)生優(yōu)育檢測(cè)；腫瘤標(biāo)志物及瘤基因檢測(cè)實(shí)現(xiàn)腫瘤病診斷；遺傳基因檢測(cè)實(shí)現(xiàn)遺傳病診斷。
動(dòng)物疾病檢測(cè)：禽流感、新城疫、口蹄疫、豬瘟、沙門菌、大腸埃希菌、胸膜肺炎放線桿菌、寄生蟲病等、炭疽芽孢桿菌。
食品安全：食源微生物、食品過(guò)敏源、轉(zhuǎn)基因、乳品企業(yè)阪崎腸桿菌等檢測(cè)。
科學(xué)研究：醫(yī)學(xué)、農(nóng)牧、生物相關(guān)分子生物學(xué)定量研究。
應(yīng)用行業(yè)：各級(jí)各類醫(yī)療機(jī)構(gòu)、大學(xué)及研究所、CDC、檢驗(yàn)檢疫局、獸醫(yī)站、食品企業(yè)及乳品廠等。
三、熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)內(nèi)容
服務(wù)名稱 內(nèi)容說(shuō)明
qPCR—引物設(shè)計(jì) 引物設(shè)計(jì)
qPCR—構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品 用于絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)品
qPCR—標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 用濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量，計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線
qPCR—相對(duì)定量 每個(gè)樣品重復(fù)三次，內(nèi)參重復(fù)三次，包含反轉(zhuǎn)錄、引物合成費(fèi)用、內(nèi)參基因費(fèi)用
qPCR—絕對(duì)定量 含標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)曲等
四、實(shí)驗(yàn)要求
客戶提供：
1.進(jìn)行mRNA表達(dá)量分析時(shí)，如果提供的材料為Total RNA，請(qǐng)寄送足量的并且保證純度的Total RNA(濃度在200 ng/μl以上，體積在20 μl
以上，純度A260/280在1.8-2.0間)。如果目的基因表達(dá)量低時(shí)，應(yīng)盡量提供更高濃度的Total RNA。
2.如果提供的材料為細(xì)胞或組織，DNA、RNA的提取費(fèi)用另收。 同時(shí)應(yīng)保證材料新鮮，動(dòng)物細(xì)胞數(shù)為106以上，動(dòng)物組織為100 mg以上。 3.目的基因信息(GenBank Acc、Gene ID、關(guān)鍵詞)，mRNA需說(shuō)明具體剪接子及檢測(cè)范圍（公共區(qū)域或特異性區(qū)域）。
4.引物設(shè)計(jì)的區(qū)域范圍(全序列、5′端序列、3′端序列)。
公司提供：樣品質(zhì)檢報(bào)告、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)報(bào)告、定量結(jié)果報(bào)告（擴(kuò)增反應(yīng)報(bào)告、溶解曲線報(bào)告和熒光定量數(shù)據(jù)結(jié)果及柱狀圖）。
五、注意事項(xiàng)及常見問題
Q: 如何選擇合適的內(nèi)參基因？
A：常見物種做mRNA使用actin做內(nèi)參，miRNA檢測(cè)使用U6做內(nèi)參，特殊物種根據(jù)文獻(xiàn)選擇合適的內(nèi)參。對(duì)于一些無(wú)法確定內(nèi)參的物種，我們可以提供內(nèi)參基因篩選服務(wù)，選出穩(wěn)定的內(nèi)參用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
Q: 引物出現(xiàn)非特異怎么解決？
A：提高退火溫度；減少引物量；重新設(shè)計(jì)引物。
Q: 絕對(duì)定量與相對(duì)定量有什么區(qū)別？
A：絕對(duì)定量的目的是測(cè)定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，即通常所說(shuō)的拷貝數(shù)。相對(duì)定量的目的是測(cè)定目的基因在兩個(gè)或多個(gè)樣本中的含量的相對(duì)比例，而不需要知道它們?cè)诿總�(gè)樣本中的拷貝數(shù)。絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)必須使用已知拷貝數(shù)的絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對(duì)定量可以做標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可以不做標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)有兩種方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法和CT值比較法。如果使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，可以使用絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，也可以使用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，而且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品在實(shí)驗(yàn)操作上更為簡(jiǎn)便易行。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品是只知道樣品中DNA或RNA的稀釋比例而不需要知道其分子數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)品，典型的做法是將一個(gè)已知pg數(shù)的樣品做一系列梯度稀釋。
熒光定量PCR( realtime fluores-cence quantitative PCR，RTFQ PCR) 是1996 年由美國(guó)Applied Biosystems 公司推出的一種新定量試驗(yàn)技術(shù)，它是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，從而對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR過(guò)程中，熒光染料能特異性摻入DNA雙鏈，發(fā)出熒光信號(hào)，而不摻入雙鏈中的染料分子不發(fā)出熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物增加完全同步。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是一次DNA定量技術(shù)的飛躍，運(yùn)用該項(xiàng)技術(shù)，可以對(duì)DNA 、RNA樣品進(jìn)行定量和定性分析。
二、熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域
臨床疾病診斷：各型肝炎、艾滋病、禽流感、結(jié)核、性病等傳染病診斷和療效評(píng)價(jià)；地中海貧血、血友病、性別發(fā)育異常、智力低下綜合癥、胎兒畸形等優(yōu)生優(yōu)育檢測(cè)；腫瘤標(biāo)志物及瘤基因檢測(cè)實(shí)現(xiàn)腫瘤病診斷；遺傳基因檢測(cè)實(shí)現(xiàn)遺傳病診斷。
動(dòng)物疾病檢測(cè)：禽流感、新城疫、口蹄疫、豬瘟、沙門菌、大腸埃希菌、胸膜肺炎放線桿菌、寄生蟲病等、炭疽芽孢桿菌。
食品安全：食源微生物、食品過(guò)敏源、轉(zhuǎn)基因、乳品企業(yè)阪崎腸桿菌等檢測(cè)。
科學(xué)研究：醫(yī)學(xué)、農(nóng)牧、生物相關(guān)分子生物學(xué)定量研究。
應(yīng)用行業(yè)：各級(jí)各類醫(yī)療機(jī)構(gòu)、大學(xué)及研究所、CDC、檢驗(yàn)檢疫局、獸醫(yī)站、食品企業(yè)及乳品廠等。
三、熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)內(nèi)容
服務(wù)名稱 內(nèi)容說(shuō)明
qPCR—引物設(shè)計(jì) 引物設(shè)計(jì)
qPCR—構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品 用于絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)品
qPCR—標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 用濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量，計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線
qPCR—相對(duì)定量 每個(gè)樣品重復(fù)三次，內(nèi)參重復(fù)三次，包含反轉(zhuǎn)錄、引物合成費(fèi)用、內(nèi)參基因費(fèi)用
qPCR—絕對(duì)定量 含標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)曲等
四、實(shí)驗(yàn)要求
客戶提供：
1.進(jìn)行mRNA表達(dá)量分析時(shí)，如果提供的材料為Total RNA，請(qǐng)寄送足量的并且保證純度的Total RNA(濃度在200 ng/μl以上，體積在20 μl
以上，純度A260/280在1.8-2.0間)。如果目的基因表達(dá)量低時(shí)，應(yīng)盡量提供更高濃度的Total RNA。
2.如果提供的材料為細(xì)胞或組織，DNA、RNA的提取費(fèi)用另收。 同時(shí)應(yīng)保證材料新鮮，動(dòng)物細(xì)胞數(shù)為106以上，動(dòng)物組織為100 mg以上。 3.目的基因信息(GenBank Acc、Gene ID、關(guān)鍵詞)，mRNA需說(shuō)明具體剪接子及檢測(cè)范圍（公共區(qū)域或特異性區(qū)域）。
4.引物設(shè)計(jì)的區(qū)域范圍(全序列、5′端序列、3′端序列)。
公司提供：樣品質(zhì)檢報(bào)告、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)報(bào)告、定量結(jié)果報(bào)告（擴(kuò)增反應(yīng)報(bào)告、溶解曲線報(bào)告和熒光定量數(shù)據(jù)結(jié)果及柱狀圖）。
五、注意事項(xiàng)及常見問題
Q: 如何選擇合適的內(nèi)參基因？
A：常見物種做mRNA使用actin做內(nèi)參，miRNA檢測(cè)使用U6做內(nèi)參，特殊物種根據(jù)文獻(xiàn)選擇合適的內(nèi)參。對(duì)于一些無(wú)法確定內(nèi)參的物種，我們可以提供內(nèi)參基因篩選服務(wù)，選出穩(wěn)定的內(nèi)參用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
Q: 引物出現(xiàn)非特異怎么解決？
A：提高退火溫度；減少引物量；重新設(shè)計(jì)引物。
Q: 絕對(duì)定量與相對(duì)定量有什么區(qū)別？
A：絕對(duì)定量的目的是測(cè)定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，即通常所說(shuō)的拷貝數(shù)。相對(duì)定量的目的是測(cè)定目的基因在兩個(gè)或多個(gè)樣本中的含量的相對(duì)比例，而不需要知道它們?cè)诿總�(gè)樣本中的拷貝數(shù)。絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)必須使用已知拷貝數(shù)的絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對(duì)定量可以做標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可以不做標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)有兩種方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法和CT值比較法。如果使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，可以使用絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，也可以使用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，而且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品在實(shí)驗(yàn)操作上更為簡(jiǎn)便易行。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品是只知道樣品中DNA或RNA的稀釋比例而不需要知道其分子數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)品，典型的做法是將一個(gè)已知pg數(shù)的樣品做一系列梯度稀釋。
