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elisa包被,elisa試劑盒包被條件
點(diǎn)擊次數(shù)：2958 日期：2014/5/28 13:07:42
elisa包被,elisa試劑盒包被條件
包被即是抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面的過程。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用于。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。載體對(duì)不同蛋白質(zhì)的吸附能力是不相同的，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。IgG對(duì)聚苯乙烯等固相具有較強(qiáng)的吸附力，其聯(lián)結(jié)多發(fā)生在Fc段上，抗體結(jié)合點(diǎn)暴露于外，因此抗體的包被一般均采用直接吸附法。蛋白質(zhì)抗原大多也可采用與抗體相似的方法包被。當(dāng)抗原決定簇存在于或鄰近于疏水區(qū)域時(shí)，抗原與固相載體的直接吸附可使抗原決定簇不能充分暴露，在這種情況下，直接包被效果不佳，可以采用間接的捕獲包被法，即先將針對(duì)該抗原的特異抗體作預(yù)包被，其后通過抗原抗體反應(yīng)使抗原固相化。此間接結(jié)合在固相上的抗原遠(yuǎn)離載體表面，其抗原決定簇也得以充分暴露。間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法,試驗(yàn)的特異性、敏感性均由此得以改善，重復(fù)性亦佳。間接包被的另一優(yōu)點(diǎn)是抗原用量少，僅為直接包被的110乃至于100。不易吸附在聚苯乙烯載體上的非蛋白質(zhì)抗原可采用特殊的包被方式。例如，在檢測抗DNA抗體時(shí)，需用DNA作為包被抗原，而普遍的固相載體一般不能直接與核酸結(jié)合。可將聚苯乙烯板先經(jīng)紫外線照射（例如30W紫外燈，75cm照射12小時(shí)），以增加其吸附性能。固相載體先用堿性蛋白質(zhì)，如聚賴氨酸、魚精蛋白等作預(yù)包被，也可提高核酸的結(jié)合力。也可用親和素生物素系統(tǒng)作間接包被，即用親和素先包被載體，然后加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。
脂類物質(zhì)無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面�？剐牧字贵w的ELISA試劑一般采用這種包被方式。
ELISA包被時(shí)我們通常使用PH9.6的緩沖液的原因是什么呀，為什么不用中性或酸性的包被液呢。
包被緩沖液的選擇要依靠你所包被的物質(zhì)而定,沒有絕對(duì)的選擇,但有一個(gè)原則就是要盡可能的保持包被物的活性不被損失.目前常用的包被緩沖液有PBS,CBS,tris鹽緩沖液,咪脞緩沖液等,一般來說,緩沖液的pH要大于蛋白質(zhì)的pI,以保持其活性.
堿性包被液如碳緩用的較多，尤其是在小分子和載體蛋白的偶聯(lián)物的包被，其主要的優(yōu)勢在于堿性環(huán)境可以使蛋白更容易的與板子結(jié)合。
也有用PBS和檸檬酸緩的，但是比較少見，
碳緩效果很好，又易于配置，所以CC用的*多啊
為什么緩沖液的PH大于蛋白的PI包被效果好呢，跟蛋白的帶電荷情況有沒有關(guān)系，
蛋白和聚苯乙烯板子結(jié)合的詳細(xì)過程目前上不是很明了，目前認(rèn)為是通過靜電吸附在板子上的，而聚苯乙烯板子一般在出廠前也要經(jīng)過強(qiáng)電廠處理以提高吸附能力！肯定和蛋白的帶電情況有關(guān)，包被緩沖液并不一定都是PH9.6 的CB，不同的蛋白選用不同的包被緩沖液可以得*佳的包被效果，從上面可以看出和蛋白的帶電情況有明顯的相關(guān)性！
為什么緩沖液的PH要大于包被蛋白的PI？
一是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與酶標(biāo)板的結(jié)合主要是靠疏水作用的物理吸附。而緩沖液的PH略大于包被蛋白的PI，有利于蛋白質(zhì)疏水鍵的適當(dāng)暴露。
二是因?yàn)槊笜?biāo)板聚苯乙烯表面暴露的主要是C－H鍵，而緩沖液的PH略大于包被蛋白的PI，可以使蛋白質(zhì)帶上負(fù)電荷，有利于蛋白質(zhì)與酶標(biāo)板的牢固結(jié)合，提高包被效率。所以我們常用的包被液體多位PH9.6的碳酸氫鈉緩沖液，當(dāng)然對(duì)PI低的蛋白質(zhì)也有使用PH7.4的包被液的情況。
*重要的原因：防止蛋白和蛋白的吸附
包被即是抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面的過程。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用于。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。載體對(duì)不同蛋白質(zhì)的吸附能力是不相同的，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。IgG對(duì)聚苯乙烯等固相具有較強(qiáng)的吸附力，其聯(lián)結(jié)多發(fā)生在Fc段上，抗體結(jié)合點(diǎn)暴露于外，因此抗體的包被一般均采用直接吸附法。蛋白質(zhì)抗原大多也可采用與抗體相似的方法包被。當(dāng)抗原決定簇存在于或鄰近于疏水區(qū)域時(shí)，抗原與固相載體的直接吸附可使抗原決定簇不能充分暴露，在這種情況下，直接包被效果不佳，可以采用間接的捕獲包被法，即先將針對(duì)該抗原的特異抗體作預(yù)包被，其后通過抗原抗體反應(yīng)使抗原固相化。此間接結(jié)合在固相上的抗原遠(yuǎn)離載體表面，其抗原決定簇也得以充分暴露。間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法,試驗(yàn)的特異性、敏感性均由此得以改善，重復(fù)性亦佳。間接包被的另一優(yōu)點(diǎn)是抗原用量少，僅為直接包被的110乃至于100。不易吸附在聚苯乙烯載體上的非蛋白質(zhì)抗原可采用特殊的包被方式。例如，在檢測抗DNA抗體時(shí)，需用DNA作為包被抗原，而普遍的固相載體一般不能直接與核酸結(jié)合。可將聚苯乙烯板先經(jīng)紫外線照射（例如30W紫外燈，75cm照射12小時(shí)），以增加其吸附性能。固相載體先用堿性蛋白質(zhì)，如聚賴氨酸、魚精蛋白等作預(yù)包被，也可提高核酸的結(jié)合力。也可用親和素生物素系統(tǒng)作間接包被，即用親和素先包被載體，然后加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。
脂類物質(zhì)無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面�？剐牧字贵w的ELISA試劑一般采用這種包被方式。
ELISA包被時(shí)我們通常使用PH9.6的緩沖液的原因是什么呀，為什么不用中性或酸性的包被液呢。
包被緩沖液的選擇要依靠你所包被的物質(zhì)而定,沒有絕對(duì)的選擇,但有一個(gè)原則就是要盡可能的保持包被物的活性不被損失.目前常用的包被緩沖液有PBS,CBS,tris鹽緩沖液,咪脞緩沖液等,一般來說,緩沖液的pH要大于蛋白質(zhì)的pI,以保持其活性.
堿性包被液如碳緩用的較多，尤其是在小分子和載體蛋白的偶聯(lián)物的包被，其主要的優(yōu)勢在于堿性環(huán)境可以使蛋白更容易的與板子結(jié)合。
也有用PBS和檸檬酸緩的，但是比較少見，
碳緩效果很好，又易于配置，所以CC用的*多啊
為什么緩沖液的PH大于蛋白的PI包被效果好呢，跟蛋白的帶電荷情況有沒有關(guān)系，
蛋白和聚苯乙烯板子結(jié)合的詳細(xì)過程目前上不是很明了，目前認(rèn)為是通過靜電吸附在板子上的，而聚苯乙烯板子一般在出廠前也要經(jīng)過強(qiáng)電廠處理以提高吸附能力！肯定和蛋白的帶電情況有關(guān)，包被緩沖液并不一定都是PH9.6 的CB，不同的蛋白選用不同的包被緩沖液可以得*佳的包被效果，從上面可以看出和蛋白的帶電情況有明顯的相關(guān)性！
為什么緩沖液的PH要大于包被蛋白的PI？
一是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與酶標(biāo)板的結(jié)合主要是靠疏水作用的物理吸附。而緩沖液的PH略大于包被蛋白的PI，有利于蛋白質(zhì)疏水鍵的適當(dāng)暴露。
二是因?yàn)槊笜?biāo)板聚苯乙烯表面暴露的主要是C－H鍵，而緩沖液的PH略大于包被蛋白的PI，可以使蛋白質(zhì)帶上負(fù)電荷，有利于蛋白質(zhì)與酶標(biāo)板的牢固結(jié)合，提高包被效率。所以我們常用的包被液體多位PH9.6的碳酸氫鈉緩沖液，當(dāng)然對(duì)PI低的蛋白質(zhì)也有使用PH7.4的包被液的情況。
*重要的原因：防止蛋白和蛋白的吸附
